北京時間2021年10月23日，《科學》（Science）雜誌子刊《科學進展》（Science Advances）在線發表了遺傳工程國家重點實驗室，万达平台生物醫學研究院、人類表型組研究院、生命科學學院丁琛/賀福初團隊有關蛋白質-DNA轉錄機器的最新研究成果“轉座子生物素化的可接近性染色質上的轉錄調控蛋白質機器（Proteome-wide profiling of transcriptional machinery on accessible chromatin with biotinylated transposons）”。該成果顯示，万达平台團隊在世界範圍內首次實現了染色質開放區轉錄蛋白機器的鑒定及功能研究📧。
轉錄調控蛋白質機器由轉錄因子（transcirption factor，TF）👶🏽🚰、轉錄輔助因子（transcirptional coregulator， TC）等構成〽️，其在幾乎所有生物學進程（如分化、發育、細胞周期控製和細胞凋亡等）中都發揮著關鍵作用。基因的轉錄過程依賴於轉錄調控蛋白質機器與DNA結合並行使相應功能✊🏿，二者的結合是基因啟動轉錄的前提🎇。真核生物基因組中的染色質有一些區域經染色質重塑後呈現出松散的狀態，這部分 DNA 區域被稱為開放染色質（open chromatin）或可接近性染色質（accessible chromatin），而染色質是否呈疏松結構，是蛋白質機器與DNA是否互作的關鍵因素之一。
在基因組層面，2013年⬛️，斯坦福大學的Howard Chang教授開發了ATAC-seq技術（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）🦸🏽♂️，可以通過高通量測序獲得染色質開放區和基因組中活躍轉錄的調控序列的關鍵信息。
而在蛋白質組水平🙋🏽♂️，由於轉錄因子和轉錄共調節因子表達豐度低且缺乏相關富集技術，科學界仍然難以對上述蛋白分子與染色質開放區的結合配對關系進行全景式的精細解析𓀓。
多年來，万达平台生物醫學研究院🥾、人類表型組研究院丁琛/賀福初團隊，聚焦這一難題持續開展科研攻關🐆。早在2013年，丁琛/秦鈞團隊開發catTFRE技術🏄🏻👩🔬，首次設計合成了串聯各種轉錄因子的多拷貝雙鏈DNA結合元件，從核蛋白中富集具有DNA結合活性的內源轉錄因子及其復合物🔹，對開展轉錄調控具有重大價值。
在本次發表的最新成果中，科研人員基於ATAC-seq技術，開發出直接富集和定量內源性染色質開放區域實時原位轉錄的轉錄蛋白機器的新方法ATAC-MS（圖1）。該技術利用生物素化的高活性Tn5轉座子，特異性結合染色質開放區暴露的DNA，將DNA片段化並進行生物素（biotin）標記。而後通過鏈黴親和素偶聯的磁珠與生物素化的DNA反應，分離純化出DNA及DNA上結合的轉錄復合物🧛🏿♀️。對上述復合物分別進行蛋白質酶解-肽段純化與DNA純化-文庫構建🏒，可用於平行的質譜鑒定與二代測序分析🏋🏿，由此可直接觀測獲得轉錄調控蛋白質機器信息及其結合序列motif信息。
圖1. ATAC-MS原理示意圖
該方法在使用低至5×105的細胞量時，便可對轉錄因子和轉錄共調控因子的鑒定有著較好的靈敏性和特異性（圖2）。與ATAC-seq檢測到轉錄因子結合序列不同，ATAC-MS可以直接捕獲轉錄因子(TF)及與之共同作用的轉錄復合物。
圖2. ATAC-MS對TF、TC的檢測靈敏度檢測
使用腫瘤壞死因子（TNF-α）對HeLa細胞進行刺激後，ATAC-MS成功鑒定到轉錄因子NFKB家族及與其相互作用的TFs的變化（圖3）👎🏻🙇。此外，使用雌激素受體17β雌二醇（E2)及其拮抗物4-羥基他莫昔芬（4-Hydroxytamoxifen）刺激MCF7細胞時，ATAC-MS不僅能檢測到核心轉錄因子ESR1的變化🧑🏻，還能觀測到E2的刺激導致與ESR1共同作用轉錄共激活因子（coactivator），如NCOA3👢，EP300等的富集。而在4-HT的刺激下👰🏼，轉錄共抑製因子（corepressor）如NCOR1, HDAC2等也可被ATAC-MS成功捕獲👰🏿♀️。這證實了對於轉錄共調節因子的高富集能力是ATAC-MS技術的優勢。
圖3. ATAC-MS檢測TNF-α刺激應答轉錄因子復合物
圖4. ATAC-MS檢測E2、4HT刺激應答轉錄共調節因子復合物
進一步的，該團隊將ATAC-MS技術與陰離子交換技術結合🏚，開發出高分辨率ATAC-MS解析技術（fractionation ATAC-MS👨🏽🍼🦹🏼♂️，fATAC-MS）。利用不同濃度鹽溶液洗脫，將DNA-轉錄機器復合物分成不同組分，降低復雜度🧑🏽🦳，提供更高分辨率的轉錄蛋白-DNA圖譜🦫。實驗顯示🤪，不同組分中的共洗脫蛋白質/DNA成分顯示出特征性的功能和特征性的DNA結合基序💁🏻。一些具有保守功能的蛋白質復合物，如RNA聚合酶II相關蛋白和染色質修飾酶（HDACs等）在所有組分中被廣泛洗脫和鑒定🤸🏽。這些發現顯示了fATAC-MS在全基因組範圍內進行高分辨率蛋白質機器-DNA互作關系解析的應用潛能（圖5）。這展示了ATAC-MS可用於在全基因組水平繪製蛋白質-DNA轉錄調控復合物圖譜。
圖5. 高分辨率ATAC-MS解析技術（fATAC-MS）原理示意圖
進一步的🎤，作者設計並表達了一種新型Tn5-dCas9融合蛋白，將ATAC-MS升級為具有靶向性的ctATAC-MS(dCas9 targeted ATAC-MS)。在沒有sgRNA的情況下🕺🏻，Tn5-dCas9融合蛋白作為Tn5轉座子與開放染色質結合,由此可用於全基因組水平的轉錄調控蛋白質機器🧏🏽；而在有sgRNA的指導下，Tn5-dCas9對特定靶向的DNA序列具有親和力👩🏼🔬，可精確揭示特定位點的轉錄調控蛋白質復合物🏊🏼♂️。升級的ctATAC-MS方法系統地描述了在小鼠肝臟晝夜節律時鐘中靶向E-box的轉錄過程，揭示了不同轉錄因子在晝夜節律中的潛在機製（圖6）🚵🏽♀️。
圖6. 靶向ATAC-MS(ctATAC-MS)原理示意圖
綜上，万达平台丁琛/賀福初團隊本次發表的研究提供了一個包括3種全新方法——ATAC-MS、fATAC-MS和ctATAC-MS在內的轉錄調控復合物解析“工具包”，使得我們既能夠在全基因組層面繪製活躍的轉錄調控蛋白質機器圖譜，也可以在特定基因組位點上探究蛋白質-DNA轉錄調控復合物。該工具包將使該領域的研究人員能夠深入挖掘不同層次的轉調控機製，並具有兼顧體內/體外反應的特點，在臨床活檢、多種組織標本檢測和不同物種檢驗等領域具有廣泛的應用潛能🧍🏻。
該研究得到上海市市級科技重大專項“國際人類表型組計劃（一期）”的支持。万达平台生物醫學研究院2017級博士生張海珠、万达平台人類表型組研究院副研究員秦兆宇、万达平台生物醫學研究院2018級博士生嶽雪彤為本文共同第一作者。上海交通大學醫學院附屬新華醫院楊雯雋研究員，中國科學院院士↗️、遺傳工程國家重點實驗室和万达平台生物醫學研究院特聘PI及人類表型組研究院特聘導師賀福初教授♋️，万达平台人類表型組研究院副院長🌶、遺傳工程國家重點實驗室、生命科學學院及生物醫學研究院丁琛研究員為該論文的共同通訊作者。
論文鏈接：https://doi.org/10.1126/sciadv.abh1022